被廣泛使用的傳統(tǒng)ChIP-seq與新技術(shù)CUT&RUN和CUT&Tag，如何決定哪種染色質(zhì)分析法更適合您的實(shí)驗(yàn)?zāi)?？在這里，我們將根據(jù)EpiCypher的經(jīng)驗(yàn)幫您確定最佳檢測(cè)方法。

關(guān)鍵點(diǎn)1：為何要告別ChIP-seq？

● 樣本要上百萬(wàn)個(gè)細(xì)胞——不適用于珍貴細(xì)胞類(lèi)型或臨床樣本

● 繁瑣的操作步驟——需要交聯(lián)、染色質(zhì)片段化和免疫沉淀(IP)，實(shí)驗(yàn)周期約為一周

● 高測(cè)序深度——通常需要每個(gè)庫(kù)2,000 - 4,000萬(wàn)個(gè)讀段才能在背景上獲得足夠的信號(hào)

● 數(shù)據(jù)結(jié)果不精準(zhǔn) ——背景高，實(shí)驗(yàn)重復(fù)性差和有非特異性的peak

盡管存在以上短板，ChIP-seq仍然是幾十年來(lái)應(yīng)用最guang泛的DNA-蛋白互作技術(shù)。然而，新方法、新技術(shù)往往給科學(xué)研究帶來(lái)天翻地覆的變化，CUTANA™ CUT&RUN和CUT&Tag的出現(xiàn)解決了ChIP-Seq實(shí)驗(yàn)需要大量細(xì)胞，且重復(fù)性差、低信號(hào)、高背景等缺點(diǎn)，為研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用提供了新的有效工具。

Figure 1: ChIP-seq與CUT&RUN和CUT&Tag的比較

與ChIP-seq相比，CUT&Tag和CUT&RUN具有許多優(yōu)點(diǎn)。這兩種檢測(cè)方法都不需要交聯(lián)、染色質(zhì)片段化或免疫沉淀，即可提供低背景、高可靠性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。同時(shí)CUT&RUN和CUT&Tag的實(shí)驗(yàn)周期更短，所需樣本細(xì)胞更少，測(cè)序深度更低。

常見(jiàn)問(wèn)題 

科學(xué)方法在不斷發(fā)展，在表觀基因組學(xué)領(lǐng)域尤其如此，在過(guò)去的十年中，表觀基因組學(xué)經(jīng)歷了快速的技術(shù)增長(zhǎng)和擴(kuò)張。盡管CUTANA™檢測(cè)具有明顯的優(yōu)勢(shì)，但許多研究人員對(duì)從ChIP-seq轉(zhuǎn)換到CUTANA™仍很猶豫。在這里，我們羅列出可能會(huì)在ChIP-seq過(guò)渡到CUTANA™ CUT&RUN分析時(shí)常見(jiàn)的一些問(wèn)題。

Q：我正在研究一種瞬態(tài)相互作用蛋白質(zhì)，需要通過(guò)交聯(lián)來(lái)穩(wěn)定染色質(zhì)上的目標(biāo)定位。我zui-好的選擇不是ChIP-seq嗎?

A: CUT&RUN可以生成背景干凈的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，免受高度交聯(lián)相關(guān)的可變IP效率的干擾。如果需要，CUTANA檢測(cè)可與輕到中度交聯(lián)條件兼容(Fig. 2)。然而，ChIP-seq所需的高度固定方式不能應(yīng)用于CUT&RUN(或CUT&Tag)。 

Figure 2: CUT&RUN在樣品處理過(guò)程中保留了全基因組富集。熱圖中使用新鮮、冷凍或交聯(lián)的K562細(xì)胞和新鮮細(xì)胞核，顯示轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的CUT&RUN H3K4me3信號(hào)，紅色表示H3K4me3高富集。

Q：我正試圖將我的結(jié)果與已有的ChIP-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行比較——我需要繼續(xù)做ChIP-seq嗎?

A：雖然ChIP-seq和CUT&RUN是不同的操作步驟，但原始測(cè)序數(shù)據(jù)是相似的，并且使用相同的工具進(jìn)行處理和可視化。在已有的文獻(xiàn)中多次發(fā)表過(guò)這兩種方法的數(shù)據(jù)比對(duì)。主要的區(qū)別是CUT&RUN數(shù)據(jù)的背景要低得多，所需的細(xì)胞和測(cè)序讀段也比ChIP-seq少了10倍。

Q：我已經(jīng)有了一個(gè)很好的ChIP-seq操作方案或有效的抗體，是否應(yīng)該堅(jiān)持用下去?

A：與CUT&RUN相比，即使是優(yōu)化后的ChIP-seq，也需要更多的時(shí)間、細(xì)胞和測(cè)序深度。此外，ChIP-seq本身存在低通量、高背景和成本較高的問(wèn)題，CUTANA™ CUT&RUN wan美的解決了這些問(wèn)題。與ChIP-seq需要交聯(lián)、片段化和IP等條件相比，CUT&RUN對(duì)大多數(shù)目標(biāo)蛋白和細(xì)胞類(lèi)型的優(yōu)化需求更低。

Q：由于抗體在ChIP中效果很好，不想換掉ChIP-seq。

A：抗體性能并不是選擇ChIP-seq的一個(gè)很好的理由。ChIP級(jí)別抗體并不可靠，尤其是組蛋白PTMs。EpiCypher發(fā)現(xiàn)超過(guò)70%的組蛋白賴(lài)氨酸甲基化和?；疨TMs抗體顯示明顯的交叉反應(yīng)性和目標(biāo)蛋白結(jié)合效率低的問(wèn)題。這包括有較高引用率的H3K4me3、H3K9me3、H3K27ac和H3K27me3抗體。非組蛋白PTM靶標(biāo)，如轉(zhuǎn)錄因子，也面臨著類(lèi)似的挑戰(zhàn)。

關(guān)鍵點(diǎn)2：CUT&RUN——“萬(wàn)能"染色質(zhì)分析工具

CUT&RUN是大多數(shù)表觀基因組實(shí)驗(yàn)的理想工具。它為細(xì)胞樣本、目標(biāo)蛋白兼容性和測(cè)序成本之間提供了很好的平衡。該技術(shù)操作非常簡(jiǎn)單，可根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)情況進(jìn)行優(yōu)化調(diào)整，且隨著EpiCypher開(kāi)發(fā)的CUTANA™ CUT&RUN試劑盒的出現(xiàn)而變得更加容易。

與ChIP-seq相比，CUT&RUN的優(yōu)點(diǎn)如下：

● 針對(duì)不同目標(biāo)蛋白的高分辨率數(shù)據(jù)：CUT&RUN與組蛋白PTMs和染色質(zhì)相關(guān)蛋白(包括轉(zhuǎn)錄因子、 表觀遺傳學(xué)的識(shí)別、記錄和消除蛋白)兼容，(圖3)。 CUT&RUN還可生成很難使用ChIP-seq進(jìn)行分析的染色質(zhì)重塑酶圖譜，這也突出了CUT&RUN的另一個(gè)關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)。

Figure 3: CUTANA™ CUT&RUN分析每次反應(yīng)僅使用300 - 800萬(wàn)測(cè)序讀段，為不同的目標(biāo)蛋白生成高分辨率數(shù)據(jù)。*每個(gè)實(shí)驗(yàn)都使用CUTANA™CUT&RUN試劑盒和500,000個(gè)K562細(xì)胞進(jìn)行。

● 需要的細(xì)胞數(shù)量較少：雖然建議使用500,000個(gè)以上的細(xì)胞，但CUTANA™ CUT&RUN在不改變操作步驟的前提下，可將細(xì)胞數(shù)量降低至5,000個(gè)，從而能夠分析不常見(jiàn)的細(xì)胞和較珍貴的樣本。目前，CUT&RUN已被用于分析小鼠和人類(lèi)原代細(xì)胞、患者來(lái)源的異種移植（PDX）、流式細(xì)胞儀分選細(xì)胞、免疫細(xì)胞等。

● 操作步驟簡(jiǎn)單：CUTANA™ CUT&RUN在3天內(nèi)即可完成從細(xì)胞到文庫(kù)的建立。還適用于多道移液器和8聯(lián)排管，提高了分析的重復(fù)性和通量。

● 測(cè)序成本降低：只需要300 - 800萬(wàn)個(gè)測(cè)序讀段，高通量測(cè)序可以檢測(cè)更多樣本。

● 減少實(shí)驗(yàn)中需要優(yōu)化的步驟：如上所述，CUT&RUN跳過(guò)了ChIP-seq中zui-具挑戰(zhàn)性的部分(染色質(zhì)片段化等)，只需要較少的優(yōu)化步驟。EpiCypher的CUTANA™CUT&RUN Kit和CUT&RUN Library Prep Kit使這一過(guò)程更加簡(jiǎn)單。

注：根據(jù)EpiCypher的經(jīng)驗(yàn)，與CUT&Tag相比，CUT&RUN更容易學(xué)習(xí)和排除故障，特別是在使用EpiCypher的CUT&RUN檢測(cè)試劑盒和Library Prep試劑盒時(shí)。

關(guān)鍵點(diǎn)3：CUT&Tag——“專(zhuān)業(yè)級(jí)別"染色質(zhì)分析工具

CUT&Tag更適合在染色質(zhì)分析測(cè)定方面具有經(jīng)驗(yàn)的研究人員。如果您是：

● 剛剛開(kāi)始接觸表觀基因組分析測(cè)定

● 經(jīng)常使用ChIP-seq，打算開(kāi)始嘗試CUTANA染色質(zhì)分析

● 打算嘗試一個(gè)新的目標(biāo)蛋白或使用一個(gè)新的細(xì)胞類(lèi)型

● 低豐度目標(biāo)蛋白，如轉(zhuǎn)錄因子和其他染色質(zhì)相關(guān)蛋白

在這些情況中，EpiCypher建議使用CUT&RUN，它有一個(gè)簡(jiǎn)單明了的操作步驟，并可為大多數(shù)目標(biāo)蛋白和細(xì)胞類(lèi)型生成可靠精準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

CUT&Tag比CUT&RUN更具挑戰(zhàn)性

許多研究人員想要用CUTANA CUT&Tag進(jìn)行染色質(zhì)分析實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樵摲椒ㄌ^(guò)了傳統(tǒng)的文庫(kù)準(zhǔn)備步驟，只需要10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞核即可獲得高質(zhì)量的測(cè)序結(jié)果。EpiCypher通過(guò)du-家的Direct-to-PCR技術(shù)進(jìn)一步簡(jiǎn)化了CUT&Tag過(guò)程，只需要一個(gè)管就可完成從細(xì)胞到PCR文庫(kù)擴(kuò)增。

盡管存在以上優(yōu)勢(shì)，根據(jù)EpiCypher的經(jīng)驗(yàn)，CUT&Tag對(duì)相關(guān)實(shí)驗(yàn)操作熟悉度有較高的要求。樣品準(zhǔn)備不充分或細(xì)胞核太少，ConA bead丟失和抗體特異性或效率較低都會(huì)影響CUT&Tag的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與CUT&RUN相比，CUT&Tag也會(huì)容易出現(xiàn)更高的duplication rates，并可能在開(kāi)放染色質(zhì)區(qū)域出現(xiàn)背景信號(hào)。基于這些原因，我們推薦大多數(shù)用戶(hù)使用CUT&RUN。

CUT&Tag并不適用于所有目標(biāo)蛋白

EpiCypher推薦使用CUTANA™ CUT&Tag來(lái)研究組蛋白PTMs(圖4)和選擇轉(zhuǎn)錄因子(即CTCF)在全基因組上的結(jié)合或分布位點(diǎn)。不建議將CUT&Tag用于染色質(zhì)相關(guān)蛋白分析，這些蛋白通常與染色質(zhì)結(jié)合較弱，在高鹽CUT&Tag溶液中剝離。這是該方法的一個(gè)主要缺點(diǎn)，也是EpiCypher繼續(xù)建議大多數(shù)用戶(hù)使用CUT&RUN的原因之一。

注:在ChIP中，樣品被交聯(lián)以穩(wěn)定染色質(zhì)上的蛋白質(zhì)，因此允許使用高鹽緩沖液。雖然CUT&Tag與輕度到中度交聯(lián)兼容，但這些條件嚴(yán)重降低了收率。相反，EpiCypher建議在CUT&RUN中使用新鮮細(xì)胞樣本。

Figure 4: CUTANA™ CUT&Tag是分析組蛋白PTMs的理想工具。

CUT&Tag是低樣本量和特殊應(yīng)用的理想選擇

盡管上面列出了一些注意事項(xiàng)，但值得注意的是CUT&Tag是專(zhuān)門(mén)為少量細(xì)胞的染色質(zhì)分析而設(shè)計(jì)的，是CUT&RUN的補(bǔ)充技術(shù)。

為什么CUTANA™ CUT&Tag是低樣本量應(yīng)用的理想選擇?

● Tn5 tagmentation消除了傳統(tǒng)的交聯(lián)、染色質(zhì)片段化、IP和文庫(kù)準(zhǔn)備步驟，減少了操作時(shí)間并zui大化靶標(biāo)回收率。當(dāng)嘗試用少量或單細(xì)胞進(jìn)行分析時(shí)，精簡(jiǎn)的處理步驟是至關(guān)重要的。在CUT&Tag中，pAG-Tn5準(zhǔn)確導(dǎo)向結(jié)合區(qū)域并進(jìn)行DNA切割，省去了ChIP-seq中最耗時(shí)的步驟。

● EpiCypher獨(dú)jia的Direct-to-PCR CUT&Tag技術(shù)允許您在一個(gè)管中完成從細(xì)胞到PCR文庫(kù)的擴(kuò)增。而每次細(xì)胞/DNA被洗滌，轉(zhuǎn)移到新的試管中，或在進(jìn)行純化時(shí)，都會(huì)面臨丟失樣本的風(fēng)險(xiǎn)。Direct-to-PCR CUT&Tag只需要一個(gè)DNA純化步驟，可以在短短兩天內(nèi)完成。

● CUTANA CUT&Tag操作中shou選100,000個(gè)核，但對(duì)于一些選定的目標(biāo)，可低至1,000個(gè)核(圖5)。由于CUTANA CUT&RUN分析驗(yàn)證過(guò)的最少是5,000個(gè)細(xì)胞，因此CUT&Tag為研究人員突破表觀基因組學(xué)的檢測(cè)界限提供了解決方法。

Figure 5: CUT&Tag僅使用1000個(gè)細(xì)胞即可生成低豐度(H3K4me3)和高豐度(H3K27me3)組蛋白PTMs的高質(zhì)量圖譜。

選擇適合您的染色質(zhì)分析測(cè)定方法 

下面是一個(gè)快速檢查表，可以幫助您為您的項(xiàng)目選擇最佳的檢測(cè)方法:

（一）推薦使用CUT&RUN作為首xuan的染色質(zhì)分析檢測(cè)方法，適用于多種目標(biāo)蛋白、細(xì)胞類(lèi)型和細(xì)胞處理?xiàng)l件。如果每次反應(yīng)可以有5,000到500,000個(gè)細(xì)胞，并且滿(mǎn)足以下條件，CUT&RUN為zui-優(yōu)選擇：

1．剛開(kāi)始接觸染色質(zhì)分析或CUTANA™技術(shù)

2．新的目標(biāo)蛋白或使用新的細(xì)胞類(lèi)型

（二）CUT&Tag是創(chuàng)新型應(yīng)用于極少量細(xì)胞樣本的分析方法。適合于有經(jīng)驗(yàn)的研究人員。

1．CUT&Tag適用于組蛋白PTMs分析

2．CUT&Tag實(shí)驗(yàn)條件通常需要比CUT&RUN更多的摸索及優(yōu)化

3．CUT&Tag每次反應(yīng)需要1,000至100,000個(gè)細(xì)胞

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